Получение спермы без забоя самца.

МЕТОД ПРИЖИЗНЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛОВЫХ ПРОДУКТОВ ОТ САМЦОВ АФРИКАНСКОГО СОМА.

  • Кузов Антон Алексеевич,
  • Полиенко Сергей Андреевич,
  • Поляхов Вячеслав Сергеевич,
  • Ткачева Ирина Васильевна.

АННОТАЦИЯ

В индустриальной аквакультуре нерест клариевых сомов (лат. Clarias gariepinus) осложняется тем, что невозможно сдоить сперму из-за физиологических особенностей строения рыбы. Рыбоводы решают эту проблему либо через трудоёмкие процедуры (естественный нерест, резекция семенника), либо через убийство и вскрытие рыбы (забой). Нами предложен способ забора спермы через пункцию семенника рыбы с сохранением жизни производителя. В случае, если вес рыбы не превышает 2 кг процедура проводится без анестезии. Рыбу нет необходимости выдерживать после нереста отдельно от остального маточного стада. Из 65 простимулированных годовалых самцов средней навеской 1250 г 43 дали сперму с подвижными сперматозоидами объёмом 1,5±0,1 мл. Угол положения иглы к телу при пункции не играет особой роли при проведении процедуры забора. Рыба может созревать при благоприятных условиях без гонадостимулирующих инъекций.

Ключевые слова: аквакультура, рыбоводство, африканский сом, нерест, резекция, пункция гонады, рематурация, сперма, биопсия, молоки.

Цель исследований: разработать технологию прижизненного получения зрелых половых продуктов африканского клариевого сома.
Задача исследования: разработка методики цикличного получения зрелых половых продуктов африканского сома, не прибегая к хирургическому вмешательству и забою производителей.

ВВЕДЕНИЕ

При разведении клариевого сома в индустриальной аквакультуре нерестовые работы с производителями осложняются строением семяпроводящих канальцев у самцов [1] – используя современные методы физиологической и/или экологической стимуляции размножения невозможно получить семенную жидкость сцеживанием.

В современной аквакультуре широкое распространение получили 3 метода воспроизводства клариевых сомов с различными подходами к получению от самцов половых продуктов:

-нерест рыбы может быть проведён в имитации природных условий [1];

-извлечение спермы путём забоя рыбы и экстракцией семенников [2],

-извлечение спермы с помощью инвазивной процедуры – резекции (эктомии) части семенника с последующим наложением хирургического шва [3].

Экологический метод.

Рыбоводом формируется семья из нескольких самок и самцов [4], которая содержится при благоприятных для созревания условиях – кормлении [5, 6], температуре [7, 8, 9], гидрохимии [10, 11] и фотопериоде [12, 7]. При нерестовой компании семья высаживается в подготовленный пруд или бассейн с субстратом для откладывания икры [13]. После нереста семья удаляется из пруда до выклева предличинок или субстрат с икрой переносится в ёмкости для инкубации.

Физиологический метод с забоем самцов.

Этот прием применяется в большинстве рыбоводных хозяйств, где практикуют искусственное разведение африканских сомов. Маточное стадо также содержится с идеальными для созревания условиями [10]. Перед нерестовой компанией рыба 2 дня выдерживается в отдельных бассейнах без кормления. После инъецирования производителей препаратами, стимулирующих созревание гонад [14, 15, 16] перед моментом сцеживания икры у зрелых самок, происходит забой самца, вскрытие его брюшной полости и извлечение части или целой гонады с созревшими молоками (рисунок 1). Далее гонада разрезается или перетирается через сито с целью получения семенной жидкости, которая затем разбавляется водой и смешивается с икрой для оплодотворения.

При взятии половых продуктов через забой и вскрытие рыбы затрачивается около 3 минут на обработку 1 производителя. При этом самец в нересте используется однократно, что исключает ведение селекции в маточном стаде.

Необходимо так же учитывать, что самцы могут давать некачественную сперму, поэтому всегда необходимо иметь несколько запасных самцов для забоя – как правило, на 1 самку заготавливают 3 самца.

Рисунок 1. Аутопсия самца африканского сома для извлечения гонад.

Физиологический инвазивный метод с резекцией (эктомией).

Чтобы сохранить производителей живыми существует метод хирургического вмешательства для извлечения половых продуктов, описанный в статье [3]. Рыбе делают разрез брюшной стенки и извлекают часть семенника, который используют для искусственного оплодотворения. Разрез после этих манипуляций зашивают [17].

Инвазивный метод оправдан при селекционных работах с маточным стадом клариевого сома, так как при биотехнике с забоем самцов невозможно в принципе подобрать производителей и сформировать семью. Осуществляются все те же манипуляции с маточным стадом, что и при методе с забоем. Но самцы в момент отбора спермы не забиваются. При использовании метода с инвазией самца необходимо обездвижить. Для анестезии применяют новокаиновую тугую инфильтрацию в качестве местной анестезии. Общая анестезия также возможна с помощью гвоздичного масла, бензокаина, MS-222 или прописцина. После обездвиживания необходимо аккуратно сделать надрез брюшной стенки. После проведения резекции (эктомии) части семенника, оставшуюся гонаду необходимо перетянуть хирургической нитью или обработать полимерным медицинским клеем, иначе в полость тела будет изливаться семенная жидкость после наложения хирургического шва на тело рыбы. Надрез рекомендуется обработать антисептиком для местного применения (рисунок 2). Хотя клариевые сомы эволюционировали в условиях, которые развивали у этих рыб выносливость и быструю регенерацию мягких тканей [18], однако это не гарантирует 100% выживаемости самцов, так как существует риск инфицирования раны и выпадения внутренних органов. Так же сам процесс наложения шва весьма кропотливый и трудоемкий.

К недостаткам инвазивного метода можно отнести необходимость изоляции самцов, прошедших процедуру резекции, от остального стада до полного заживления швов от биопсии на коже. Если рыбу с повреждёнными кожными покровами подсадить к маточному или товарному стаду, остальные сомы агрессивно реагируют на вселенца и проявляют каннибализм, забивая самца с не зарубцевавшимся швом до смерти.

Временные затраты на проведении всех этих манипуляций – как на наложение шва, так и на регенерацию кожных покровов и последующую рематурацию [17] – возрастают в несколько раз по сравнению с простым забоем, поэтому применение инвазивного метода при промышленном разведении клариевого сома ограниченно экспериментальными или селекционными целями и для товарного производства является нецелесообразным.

Рисунок 2. Наложение шва и бактерицидная обработка повидон-йодом после резекции части гонады. Источник: http://fishconsult.org/?p=14683

Физиологический инвазивный метод с пункцией гонады.

Нами предложен альтернативный метод прижизненного получения половых продуктов у африканского сома без применения  хирургического вмешательства путём биопсии пункцией через брюшную стенку. Основой для нашего исследования послужили данные из этой статьи [19]. Инвазивную манипуляцию возможно провести без анестезии. Метод позволяет многократно использовать самцов для нескольких циклов репродукции без длительного трудозатратного процесса рематурации. Отличительной особенностью данного метода является  высокая выживаемость производителей – как правило не ниже 95%. Данный метод имеет  наивысшую скорость выполнения манипуляций с производителями из всех известных методов нереста африканского сома. Также эта процедура сокращает издержки рыбоводных хозяйств – снижается количество производителей на содержании как в маточном стаде, так и в ремонтном. В исключительных случаях, если не важна селекционная работа с производителями, зрелые самцы могут отбираться из товарного стада простым перебором.

Рыб при нересте достают из воды и помещают на процедурный стол. Анестезия производителей обычно не проводится, если они массой до 2 кг (хотя данная операция иногда применяется, если нерест проводит 1 человек). Более крупную рыбу лучше обездвижить бензокоином, прописцином, MS-222 или раствором гвоздичного масла. С помощью медицинского шприца осуществляют забор спермы  (рисунок 3), которую затем проверяют на активность и, исходя из результатов анализов, принимается решение о дальнейшем ее использовании в племенной работе с производителями.

К недостатку метода взятия половых продуктов при помощи пункции следует отнести требование сноровки и практики при отборе спермы. Так же у некоторых самцов иногда отсутствует один из семенников, что может приносить дополнительные трудности. В таких случаях возможно с помощью аппарата для УЗИ-тестирования определить расположение и зрелость гонад. Так же не рекомендуется применять шприцы и иглы для инъекций инсулина, так как они короткие и тонкие – это затрудняет забор спермы и увеличивает риск засорения канала иглы частицами тканей семенника.

Рисунок 3. Ориентирование и постановка иглы под прямым углом по отношению к телу рыбы для извлечения зрелой спермы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вид гидробионта – африканский клариевый сом (лат. Clarias gariepinus). Возраст – 1 год. Выращивание до 100 грамм производилось в УЗВ. Следующий период роста проходил в биофлоковых бассейнах с гетеротрофным активным илом. Месячный рацион рыб состоял из сухих экструдированных комбикормов для канального сома производства компании «Акварекс» с протеином 36%, 0,5% от биомассы рыб. Корм задавался равными порциями 4 раза в сутки.

Самцов брали из бассейна с температурой воды 24°С ± 0.5. За 4 дня перед нерестом проведена УЗИ-диагностика зрелости самцов клариевого сома.

При помощи препарата из карпового ацетонированного гипофиза были простимулированы 65 самцов и 25 самок, средняя масса производителей была 1250 г. Зрелые половые продукты получили от самок через 8,5 часов. После получения икры производили забор спермы от самцов. Производителя фиксировали на специальном столе (рисунок 4).

Рисунок 4. Манипуляции с самцом сома при заборе спермы.

Обездвиженную рыбу вытирали от слизи и прочих загрязнений с помощью прокипячённых х/б полотенец. Местоположение гонад определяли с помощью УЗИ-аппарата (рисунок 5). Забор семенной жидкости осуществляли с помощью стерильного шприца объемом не менее 2 мл.

Рисунок 5. Положение и постановка иглы и УЗИ-датчика.

Введение иглы шприца производили несколькими способами:

– под углом 90 ° к поверхности тела,

– под углом 45 ° краниально и каудально.

Существенных различий не было выявлено, до семенника легко можно добраться любым из вышеперечисленных методов. В связи с этим нами был выбран метод с использованием 90 ° введения иглы шприца (рисунок 6).

Рисунок 6. Забор зрелой спермы с различным положением тела самца.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Пробные пункции не стимулированных гипофизом рыб показали, что самцы, при выдерживании в условиях биофлоковой системы с подходящими температурами и кормлением, созревают без дополнительной стимуляции гормональными препаратами. Получение качественных половых продуктов при помощи пункции возможно от рыб с крупными, набухшими моче-половыми сосочками.

При использовании не качественных комбикормов или не правильных режимов кормления увеличивается риск повышенного накопления висцерального жира и перерождения гонад, в случае чего получение половых продуктов является невозможным.

После проникновения иглы в семенник могут возникнуть затруднения с получением семенной жидкости даже у хорошо созревших самцов. В связи с тем, что семенная жидкость распределена по всему семеннику не равномерно и  большая часть зрелых спермиев накапливается в отростках и зубчатом венце (рисунок 7), после попадания иглы может потребоваться легкое массирование брюшка в области семенника, в 3-5 см от места введения, что позволит упростить и ускорить забор спермы. Частицы тканей также могут попадать в отверстие иглы, забивая его.

У 43 из 65 самцов  при помощи одноразового стерильного шприца, методом пункции из семенника, получилось взять зрелую семенную жидкость в среднем объёме 1,5±0,1 мл кубических от производителя. У других самцов не удалось получить половых продуктов. Как позднее показало ультразвуковое исследование, эти самцы имели большое количество висцерального жира и не отвечали на гормональную стимуляцию. Контрольное вскрытие показало отсутствие у одного из самцов левого семенника, правый оказался не зрелым, другие самцы тоже оказались с недоразвитыми или не зрелыми семенниками.

После оплодотворения полученной таким образом спермой, икра была заложена на инкубацию в аппарат типа “Макдональда”. Выклев произошел через 20 часов при температуре 27,2 °.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Еще на стадии УЗИ тестирования можно определить развитие семенников и пригодность тестируемого производителя к дальнейшему использованию, в качестве ремонтно-маточного стада. Определение качества семенной жидкости, количества сперматозоидов в ней и их подвижность позволяют в дальнейшем сформировать стадо особей с высоким репродуктивным потенциалом и высокой оплодотворяющей способностью.

Резюмируя наши исследования, отмечаем положительные тенденции данного опыта получения половых продуктов:

  • минимальное количество затраченного времени на процедуру получения. 
  • высокая выживаемость после манипуляций
  • ведение селекционной работы и формирование семей
  • рематурация

Африканский клариевый сом обладает высокой регенерационной способностью семенников, что позволяет использовать самцов этого вида в селекционном процессе в качестве производителей неоднократно.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Constantinos C. Mylonasa, Alexis Fostierb, Silvia Zanuyc. Broodstock management and hormonal manipulations of fish reproduction, General and Comparative Endocrinology, Volume 165, Issue 3, Pages 516-534, (February 2010)
    https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2009.03.007
  2. Dariusz Kucharczyka, Daria Joanna Kucharczykb, Joanna Nowosada, Nazira Omirzhanovac, Optimization of artificial insemination outcomes of African catfish (Clarias gariepinus) with differing hatchery conditions, Animal Reproduction Science, Volume 211, 106222, (December 2019)
    https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2019.106222
  3. Sullip Kumar Majhi, Pradip Kumar Maurya, Santosh Kumar, Vindhya Mohindra, Kuldeep Kumar Lal, Non-invasive method for collection of Clarias magur (Hamilton, 1822) spermatozoa: A novel approach for catfish domestication, aquaculture and conservation, MethodsX, Volume 7, 100929, (2020)
    https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2019.734737
  4. Witsanu Srimai, Skorn Koonawootrittriron, Prapaiphan Chaivichoo, Wiroon Manee-aphai, Anake Phu-onnim, Urai Koolboon, Uthairat Na-Nakorn,Selection response and genetic parameters for growth in North African catfish, Clarias gariepinus (Burchell, 1822), Aquaculture, Volume 518, 734843, (15 March 2020),
    https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2019.734843
  5. L. Nyina-Wamwiza, S. Milla, M-A. Pierrard, E. Rurangwa, S. N. M. Mandiki, K. J. W. Van Look, P. Kestemont, Partial and Total Fish Meal Replacement by Agricultural Products in the Diets Improve Sperm Quality in African Catfish (Clarias Gariepinus), Theriogenology,  77(1), Pages 184-94 (2012 Jan 1),  Epub 2011 Oct 19.
    https://doi:10.1016/j.theriogenology.2011.07.032
  6. M.A.Essaa, H.A.Mabroukb, R.A.Mohameda, F.R.Michael, Evaluating different additive levels of yeast, Saccharomyces cerevisiae, on the growth and production performances of a hybrid of two populations of Egyptian African catfish, Clarias gariepinus, Aquaculture, Volume 320, Issues 1–2, Pages 137-141, (19 October 2011),
    https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2011.08.015
  7. Tamás Müllera, Éva Ács, Gábor Beliczky, Judit Makk, Angéla Földi, Balázs Kucska, László Horváth, Áron Ittzés, Árpád Hegyi, Tamás Szabó, Béla Urbányi, Nguyen Ngoc Quyen, László Orbán, Máté Havasi, New observations about the fertilisation capacity and latency time of sperm inseminated into the ovary of African catfish (Clarias gariepinus), an oviparous modelfish, Aquaculture Volume 522, 735109, (30 May 2020),
    https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2020.735109
  8. Saïdou Santi, Vincent Gennotte, Aboubacar Toguyeni, Charles Mélarda Nadine Antoine, Carole Rougeot, Thermosensitivity of the sex differentiation process in the African catfish, Clarias gariepinus: Determination of the thermosensitive period, Aquaculture Volume 455, Pages 73-80, (20 March 2016),
    https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2016.01.009
  9. Saïdou Santi, Vincent Gennotte, Marc Muller, Charles Melard, Aboubacar Toguyeni, Syaghalirwa N. M. Mandiki, Carole Rougeot, Sex-ratio, early sex steroid profiles and cyp19a1b, dmrt1 and foxl2 gene expressions upon high temperature treatment of undifferentiated African catfish juveniles (Clarias gariepinus), Aquaculture Volume 499, Pages 140-148, (15 January 2019),
    https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2018.09.033
  10. Julie Ekasaria, Muhammad Agus, Suprayudia Wiyoto, Wiyoto Ratih, Fauziatin Hazanaha, Gilang Satya Lenggaraa, Rosi Sulistiania, Muhammad Alkahfia, Muhammad Zairin Jr, Biofloc technology application in African catfish fingerling production: The effects on the reproductive performance of broodstock and the quality of eggs and larvae, Aquaculture, Volume 464, Pages 349-356, (1 November 2016),
    https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2016.07.013
  11. S. Asem-Hiablie, C. D. Church, H. A. Elliott, N. W. Shappell, H. L. Schoenfuss, P. Drechsel, C. F. Williams, A. L. Knopf, M. Y. Dabie, Serum Estrogenicity and Biological Responses in African Catfish Raised in Wastewater Ponds in Ghana, Science of The Total Environment, Volumes 463–464, Pages 1182-1191, (1 October 2013),
    PMID: 23849063
    DOI: 10.1016/j.scitotenv.2013.06.032
  12. Elena M.Romanovaa, Vaselina N.Lyubomirovaa, Vasiliy V.Romanov, Minzifa E.Mukhitovaa,Tatyana M.Shlenkina,  Seasonal studies of caviar production and the growth rate of the African catfish (Clarias gariepinus, Burchell, 1822),  The Egyptian Journal of Aquatic Research, Volume 44, Issue 4, Pages 315-319, (December 2018),
    https://doi.org/10.1016/j.ejar.2018.09.005
  13. José Beirão, Torvald B Egeland, Craig F Purchase, Jarle T Nordeide, Fish Sperm Competition in Hatcheries and Between Wild and Hatchery Origin Fish in Nature, Theriogenology, 133, Pages 201-209, (2019 Jul 15);.
    doi: 10.1016/j.theriogenology.2019.03.034.
  14. Safaa Sharaf, Effect of GnRHa, pimozide and Ovaprim on ovulation and plasma sex steroid hormones in African catfish Clarias gariepinus, Article (PDF Available) in Theriogenology, 77(8), Pages 1709-16 · (February 2012) 
    DOI: 10.1016/j.theriogenology.2011.12.019 · Source: PubMed
  15. Blessing B.Ajayia, John O.Ogunsolab, Olufemi I. Olatoyea, Richard E. Antiac, Samuel Agbedea, Effects of pituitary extract, ovaprim, and bitter leaf (Vernonia amygdalina) on the histopathology of African catfish (Clarias gariepinus), Aquaculture and Fisheries, Volume 3, Issue 6, Pages 232-237, (November 2018),
    https://doi.org/10.1016/j.aaf.2018.10.001
  16. Waleed N.El-Hawarrya, Soliman H.Abd El-Rahmanb, Ramy M.Shourbelaa, Breeding response and larval quality of African catfish (Clarias gariepinus, Burchell 1822) using different hormones/hormonal analogues with dopamine antagonist, The Egyptian Journal of Aquatic Research, Volume 42, Issue 2, Pages 231-239, (June 2016),
    https://doi.org/10.1016/j.ejar.2016.06.003
  17. O. T. Adebayo, E. A. Fasakin, J. A. Adewumi, Reproductive Performance of Partial Gonadectomized Male African Catfish, Clarias Gariepinus Broodstocks, Theriogenology. (2012 Apr 1); 77(6), Pages 1050-5.
    Epub 2012 Feb 10.
    PMID: 22325211
    DOI: 10.1016/j.theriogenology.2011.09.027
  18. Rüdiger W.Schulz, Wytskevan Dijk, Elena Chaves-Pozo, Ángel García-López, Luiz R. de França, Jan Bogerd, Sertoli cell proliferation in the adult testis is induced by unilateral gonadectomy in African catfish, General and Comparative Endocrinology Volume 177, Issue 1, Pages 160-167, (15 May 2012),
    https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2012.03.001
  19. Kingsley Omogiade Idahor, Microscopic observation of spermatozoa in milt collected with syringe without sacrificing the male African Catfish (Clarias anguillaris B. 1911), International Journal of Fisheries and Aquatic Studies (2014); 2(1), Pages 88-91